La Diócesis fue creada por su Santidad Juan XXIII, por medio de la Bula Eclesiarum Omnium del 16 de marzo de 1962.
El territorio tiene una superficie aproximada de 4000 Kms cuadrados, que fue segregado de la Diócesis de Cali. El 26 de abril de 1962, el mismo Juan XXIII nombró como primer Obispo de la Diócesis a Monseñor José Gabriel Calderón, hasta entonces Obispo Auxiliar de Bogotá.
La Bula de creación fue solemnemente promulgada por el Cardenal José Paupini entonces Nuncio de su Santidad en Colombia, el 26 de junio de 1962. El mismo día tomó posesión como primer Obispo Mons. Calderón.
Mons. Calderón nació en Bogotá el 15 de julio de 1919; fue ordenado sacerdote el 8 de noviembre de 1942; elegido a la sede de Titular de Victoriano, como Auxiliar del Arzobispo de Bogotá el 18 de diciembre de 1958.
Fue consagrado Obispo en Roma el 6 de enero de 1959. Trasladado a la sede de Cartago el 26 de abril de 1962. Fue recibido con pompa y solemnidad por la comunidad cartagüeña regocijada por la exaltación de su territorio a Diócesis. Un día de alborozo, desde el cual comenzó a gestarse una época de verdadera presencia de la Iglesia. Inició el Obispo un liderazgo que lo mantuvo vigente durante 33 años.
A Mons. Calderón lo sucede Mons. Luis Madrid Merlano, desde el 9 de junio de 1994 cuando tomó posesión canónica como segundo Obispo de la Diócesis. En mayo 22 de 2010 Monseñor Luis Madrid tomó posesión como Arzobispo de Nueva Pamplona. Después el excentísimo Monseñor Alberto Giraldo Jaramillo, Arzobispo Emérito de Medellín, es nombrado Administrador Apostólico de la Diócesis hasta el mes de Noviembre del mismo año, pues el 27 de ese mes toma posesión canónica de la Catedra como tercer Obispo de la Diócesis de cartago, el Excelentísimo Monseñor José Alejandro Castaño Arbelaez.